目錄

• 簡(jiǎn)介

• 主持人致辭

• 主旨報(bào)告

• 王義琴：防御素的抗病機(jī)理及研究進(jìn)展

• 交流與討論

• 邀請(qǐng)報(bào)告一

• 陳宇紅：兔防御素NP-1的規(guī)模化生產(chǎn)及其應(yīng)用研究

• 交流與討論

• 邀請(qǐng)報(bào)告二

• 鄧婷婷：小球藻表達(dá)體系研究進(jìn)展

• 交流與討論

• 主要專家簡(jiǎn)介：

• 展開(kāi)

【簡(jiǎn)介】

防御素是生物體抵御病原微生物的防御反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的一類抗微生物陽(yáng)離子短肽，它在自然界是廣泛存在的。防御素具有殺死細(xì)菌、真菌或者病毒等微生物并具有抗腫瘤活性的奇特功效，其特殊的毒性機(jī)理使得微生物難以產(chǎn)生抗性，所以防御素有望發(fā)展成為新一代的多肽抗生素藥物，從而解決目前日益嚴(yán)重的抗生素耐藥性問(wèn)題。中科院遺傳發(fā)育所的科研人員近年來(lái)在防御素的抗病機(jī)理研究、應(yīng)用研究以及通過(guò)基因工程技術(shù)開(kāi)發(fā)研究等多個(gè)方面都取得了很大進(jìn)展，本期沙龍圍繞防御素的抗病防病機(jī)理和基因工程生產(chǎn)應(yīng)用方面展開(kāi)討論，希望能提出新的觀點(diǎn)和建議。

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【主持人致辭】

安錫培：我們這次沙龍主要是討論NP1抗病機(jī)理探索及應(yīng)用前景，防御素是孫勇如老師在所里最早開(kāi)始的，2003年部隊(duì)、潛艇、海軍都用過(guò)，發(fā)的手冊(cè)上都有我就不多介紹了，下面請(qǐng)王義琴做主講。

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【主旨報(bào)告】

王義琴： 防御素的抗病機(jī)理及研究進(jìn)展

各位領(lǐng)導(dǎo)、各位專家、各位老前輩上午好，非常高興有機(jī)會(huì)今天來(lái)講一下防御素方面的進(jìn)展。我跟大家分享的是防御素抗病機(jī)理及應(yīng)用進(jìn)展。

防御素最早是由1980年美國(guó)的Robert Lehrer命名的，它是生物體在抵御病原體的防御反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的一種能拮抗微生物和一些惡性細(xì)胞的小分子短肽。防御素通常由29 ～ 54個(gè)氨基酸組成,其中包括6～8個(gè)保守半胱氨酸,可通過(guò)半胱氨酸分子內(nèi)二硫鍵使肽環(huán)形成反向平行的β片狀或α螺旋結(jié)構(gòu)。

防御素分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有非常廣譜的抗菌活性，根據(jù)來(lái)源的不同,可分為動(dòng)物防御素、植物防御素和昆蟲防御素。防御素分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有廣譜的抗菌活性，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)特征的不同,動(dòng)物防御素可分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3種。

α-防御素: 由美國(guó)Lehrer 實(shí)驗(yàn)室1980 年從兔肺巨噬細(xì)胞中首先分離得到, 是一種陽(yáng)離子性極強(qiáng)的小分子抗菌肽。α-防御素主要存在于哺乳動(dòng)物有關(guān)組織和細(xì)胞中。α-防御素分子由29~35 個(gè)氨基酸組成, 富含精氨酸, 非常保守的6 個(gè)半胱氨酸以Cys-l-Cys-6、Cys-2-Cys-4、Cys-3-Cys-5 方式形成3 對(duì)分子內(nèi)二硫鍵, 其中Cys-l-Cys-6 對(duì)二硫鍵連接N 端和C 端的半胱氨酸形成分子大環(huán), 所以α-防御素的一級(jí)結(jié)構(gòu)一般為圓形。在兔的中性粒細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)有6 種α-防御素, 即RabNP-1、-2、-3a、-3b、-4、-5, 這些防御素總量占細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的15%~20%。

RaNP-1具有非常廣譜的抑菌譜，它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、被膜病毒、真菌、梅毒螺旋體等等都有很強(qiáng)的抗性，所以對(duì)這么廣范圍的病原體都能有治療效果。

圖1. 兔防御素RaNP-1廣譜的抑菌譜

β-防御素也是由三對(duì)分子內(nèi)的二硫鍵，形成的位置跟α-防御素不同，因此結(jié)構(gòu)也不一樣。防御素的抗菌活性很強(qiáng)，但是在受到鹽濃度及血清成分影響下，α-和β-防御素的抗菌活性會(huì)降低, 但是只有12個(gè)氨基酸的θ-防御素的抗菌活性卻幾乎不受影響, 研究發(fā)現(xiàn)θ-防御素分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)可能是其保持穩(wěn)定活性的原因。

與動(dòng)物防御素相似，昆蟲和植物防御素的特點(diǎn)，昆蟲防御素也有三對(duì)二硫鍵Cys-1-Cys-4、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6，但是植物防御素通常是有四對(duì)二硫鍵Cys-1-Cys-8、Cys-2-Cys-5、Cys-3-Cys-6、Cys-4-Cys-7。

防御素有如此廣譜的抗性是在生物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中與疾病斗爭(zhēng)的結(jié)果。其抗微生物的作用機(jī)理可以分為抗菌作用機(jī)理、抗病毒的作用機(jī)理、細(xì)胞毒作用、免疫調(diào)節(jié)功能四個(gè)方面。

防御素抗菌的作用機(jī)理，目前有兩種不同的抗菌作用機(jī)理被提出,一種是獨(dú)立膜機(jī)制，另一種是防御素結(jié)合細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物的機(jī)制。獨(dú)立膜機(jī)制的觀點(diǎn)認(rèn)為, 帶正電荷的防御素與帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞膜相互吸引，并相互結(jié)合，從而破壞了磷脂雙分子層的完整性，引起靶細(xì)胞膜出現(xiàn)裂隙。可分為三個(gè)階段：(1)由靜電吸引。防御素與靶細(xì)胞膜結(jié)合。防御素帶正電荷,可通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的細(xì)菌膜脂層結(jié)合；(2)通道形成。帶正電荷的防御素分子或其多聚體則與細(xì)菌質(zhì)膜上帶負(fù)電荷的磷脂頭部和水分子相互作用,顯著地增加生物膜的通透性。防御素作用于膜上形成穩(wěn)定的多個(gè)通道；(3)內(nèi)容物外泄。通道形成后,防御素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的同時(shí),其他胞外分子也伴隨進(jìn)入(如肽、蛋白質(zhì)或無(wú)機(jī)離子),而靶細(xì)胞的重要物質(zhì)(如鹽離子和大分子)滲出，細(xì)胞膜的通透性及細(xì)胞能量狀態(tài)受到了破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及細(xì)胞ATP含量下降, 離子和大分子物質(zhì)通過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞膜, 最終導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。

圖2. 防御素的抗菌機(jī)理。

防御素與細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物結(jié)合，2013年在美國(guó)科學(xué)院院報(bào)PNAS上有篇文章報(bào)道發(fā)現(xiàn)人類β-防御素2在革蘭氏陽(yáng)性菌糞腸球菌毒力因子局部合成點(diǎn)高度聚集，從而破壞轉(zhuǎn)肽酶Sortase的定位并影響了它的功能，導(dǎo)致毒力因子合成受阻，而破壞細(xì)菌的分裂達(dá)到殺菌的作用。

防御素抗病毒的作用機(jī)理，分三類：閉門羹、突破口、地雷陣。

閉門羹-阻止病毒入侵宿主細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞采用“兩步走”政策：首先，病毒的外衣即包膜死纏爛打地粘著到細(xì)胞的外膜上；接著，病毒包膜與細(xì)胞膜融合在一起。兩個(gè)膜融合后，病毒就將它的遺傳物質(zhì)插入到細(xì)胞中。防御素則斜插在糖蛋白上以防病毒向細(xì)胞糖蛋白的擴(kuò)散，讓病毒吃個(gè)“閉門羹”無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞。沒(méi)能進(jìn)入細(xì)胞的病毒接著會(huì)被免疫系統(tǒng)的細(xì)胞摧毀。

突破口-殺滅病毒，防御素通常帶多個(gè)正的凈電荷，而病毒囊膜及其表面糖蛋白通常帶負(fù)電。這使得防御素像一塊塊小磁鐵，吸附到病毒囊膜帶負(fù)電荷的糖蛋白上。這樣便使囊膜病毒穿孔，形成突破口，內(nèi)容物外泄而死亡。這與防御素對(duì)細(xì)菌的殺滅作用相類似。

地雷陣-阻止病毒基因復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，萬(wàn)一病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，防御素可以與細(xì)胞膜表面促腎上腺皮質(zhì)激素 (ACTH)，人硫酸肝素糖蛋白（HSPG），低密度脂蛋白受體（LDLR）等相結(jié)合，從而啟動(dòng)G蛋白偶聯(lián)型受體的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，進(jìn)一步激活磷酸激酶C。這些細(xì)胞信使作用就像埋伏在胞內(nèi)的地雷，可以阻止整合到宿主基因組之前的病毒復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核或者阻止病毒的基因轉(zhuǎn)錄。整合不到宿主基因組的病毒隨后被摧毀。病毒雖然進(jìn)入細(xì)胞，但是碰到地雷就被阻止了，整合不到基因組就被消滅掉了。

隨著研究發(fā)現(xiàn)，人們發(fā)現(xiàn)防御素有細(xì)胞毒作用，它對(duì)人的淋巴細(xì)胞、實(shí)體瘤細(xì)胞毒作用更顯著的，近些年來(lái)，發(fā)表了一系列的這方面的研究文章。早在1993年，在我們國(guó)家的《中國(guó)病理生理雜志》，就有一位科技工作者做了兔中性細(xì)胞防御素的細(xì)胞毒研究，隨著濃度的升高，RaNP-1和RaNP-2對(duì)HL-60細(xì)胞系的毒性是逐漸增強(qiáng)的。對(duì)抗 TNF 的 U9TR 細(xì)胞、抗NK細(xì)胞細(xì)胞毒因子的小鼠淋巴瘤 YAC-1 細(xì)胞和人組織細(xì)胞淋巴瘤 U937 細(xì)胞具有殺傷性。在體外，HNP可抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶的活性，HNP的細(xì)胞毒活性部分依賴于靶細(xì)胞膜脂質(zhì)成分的代謝活性，它還可以與過(guò)氧化氫酶協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞毒作用。體外觀察純化防御素對(duì)人及小鼠數(shù)種腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)防御素對(duì)白血病細(xì)胞系、淋巴瘤細(xì)胞系及實(shí)體瘤細(xì)胞均具有細(xì)胞毒作用，并且這種抗腫瘤功效與其作用時(shí)間和劑量呈正相關(guān)。

防御素的免疫調(diào)節(jié)作用，防御素能夠作為一種效應(yīng)分子激活巨噬細(xì)胞、DC、氣管上皮細(xì)胞等細(xì)胞表面受體從而啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)，并將先天性免疫和獲得性免疫有機(jī)連接。防御素可以上調(diào)巨噬細(xì)胞趨化因子表達(dá)并進(jìn)一步招募T細(xì)胞、單核細(xì)胞和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和觸發(fā)適應(yīng)性免疫控制病毒感染。通過(guò)防御素腫瘤機(jī)理防御素是自身防御體系重要的組成部分，組成機(jī)理非常獨(dú)特的，是通過(guò)電荷上去的，病原物不能產(chǎn)生抗藥性。

下面簡(jiǎn)單介紹防御素研究進(jìn)展，一個(gè)是防御素功能研究進(jìn)展，在醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)畜牧業(yè)、還有防御素的基因工程研究進(jìn)展。

防御素在醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展，與口腔黏膜疾病的關(guān)系、與炎癥性腸病的關(guān)系、與慢性阻塞性肺部疾病的關(guān)系、防御素的臨床藥用研究。

防御素與口腔黏膜疾病，研究發(fā)現(xiàn)，防御素家族在口腔黏膜宿主防御及免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，與多種口腔黏膜疾病（口腔潰瘍、扁平苔蘚、白斑及口腔念珠菌病等）關(guān)系密切。現(xiàn)今關(guān)于這方面的研究尚處于起步階段，主要以體外實(shí)驗(yàn)為主，其作用機(jī)制也多為推測(cè)。感受到病毒侵染的信號(hào)，人的黏膜上皮細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生防御素β-defensin-2 (HBD2) and HBD3 來(lái)抵抗病毒。

防御素與炎癥性腸病的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，腸道上皮細(xì)胞中防御素起著影響腸道黏膜的天然屏障作用，防御素表達(dá)水平的降低會(huì)導(dǎo)致黏膜細(xì)菌附著并入侵機(jī)體引發(fā)炎癥反應(yīng)。腸道慢性炎癥疾病克羅恩病（CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（UC）均與回腸潘氏細(xì)胞防御素HD-5、HD-6 的表達(dá)相關(guān)異常相關(guān)。原理是什么？2012年在Sciene發(fā)表的研究結(jié)果顯示以防御素為主的免疫分子能夠制造納米網(wǎng)捕捉沙門氏菌等腸道微生物。

防御素與慢性阻塞性肺部疾病的關(guān)系，HBD-2 與呼吸系統(tǒng)疾病關(guān)系緊密，在肺部黏膜防御中具有重要作用。研究證實(shí)，HBD-2 的產(chǎn)生或作用被抑制后，機(jī)體將發(fā)生肺部感染，人為補(bǔ)充外源性防御素可能會(huì)阻止細(xì)菌的定植和感染的發(fā)生。已有研究證實(shí)，重組 HBD-2 對(duì)肺損傷具有保護(hù)作用，可減少綠膿桿菌感染大鼠肺組織的菌落數(shù)。

最近一篇文章是在豬里面表達(dá)β-防御素2基因（β-BD-2）增強(qiáng)對(duì)胸膜肺炎放線桿菌的抗性，野生型豬的肺部顯示出血、水腫，嚴(yán)重的擁塞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。轉(zhuǎn)基因的豬肺部表現(xiàn)出輕微出血，中度充血，輕度中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

防御素有獨(dú)特的機(jī)理，微生物不容易產(chǎn)生抗藥性，抗菌譜廣，所以它在臨床上有非常大的藥用潛力。2008年，全球首個(gè)防御素藥物（PMX-30063）在加拿大獲得批準(zhǔn)并進(jìn)行一期臨床試驗(yàn)。PMX-30063藥物的特色，全新的作用機(jī)制，細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性；對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均有活性，特別是對(duì)包括89種耐藥葡萄球菌在內(nèi)的146種葡萄球菌有抗菌活性；是一種殺菌劑，即能直接殺滅細(xì)胞而且殺菌速度快于許多抗生素；對(duì)耐藥菌有活性，包括多種耐萬(wàn)古霉素和耐甲氧西林的臨床分離株。從而有望解決日漸增多的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題！

基于昆蟲防御素的新分子設(shè)計(jì)，動(dòng)物所朱順義研究組通過(guò)單點(diǎn)突變將昆蟲防御素羧基端β-折疊片層結(jié)構(gòu)改造成典型的β-發(fā)夾肽結(jié)構(gòu),獲得的14aa的小肽命名為NvBH。研究發(fā)現(xiàn)在低的微摩爾濃度下，NvBH無(wú)論在完全氧化或部分氧化的狀態(tài)下均有較強(qiáng)的抑菌活性（包括一些耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌臨床分離株)。NvBH具有低的溶血性和高的血清穩(wěn)定性和蛋白酶抗性，使其成為一個(gè)新型的抗感染類藥物先導(dǎo)物。希望他們?cè)缛昭邪l(fā)成功。

防御素在食品工業(yè)中的可能應(yīng)用，防御素具有耐熱的特點(diǎn)，作為食品防腐劑可用于熱加工食品的防腐保鮮。此外，它還可被用于防止巴氏殺菌后的再污染。

防御素在畜牧業(yè)中的研究進(jìn)展，目前來(lái)講我們國(guó)家畜牧業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程當(dāng)中，抗生素添加劑的使用嚴(yán)重破壞了動(dòng)物腸道的微生態(tài)平衡，藥物殘留也影響了畜產(chǎn)品的品質(zhì)和人類健康，而來(lái)源于哺乳動(dòng)物的防御素相對(duì)分子質(zhì)量較小，熱穩(wěn)定性和水溶性均較好，可以在腸道內(nèi)吸收。由于防御素屬于多肽成分，在體內(nèi)容易被蛋白酶降解為氨基酸，動(dòng)物采食后在體內(nèi)一般無(wú)殘留。可以開(kāi)發(fā)成環(huán)保型防御素飼料添加劑或獸藥。目前已經(jīng)有很多商品型的重組β-防御素在進(jìn)行銷售了。

防御素的基因工程生產(chǎn)，以轉(zhuǎn)基因小球藻為生物反應(yīng)器生產(chǎn)兔防御素的研究具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，處于國(guó)際領(lǐng)先地位。小球藻是一個(gè)單細(xì)胞藻類，培養(yǎng)很簡(jiǎn)單。轉(zhuǎn)基因小球藻的高效生物反應(yīng)器特別有效，因?yàn)樾∏蛟鍐渭?xì)胞、培養(yǎng)簡(jiǎn)單；繁殖速度快、可大規(guī)模培養(yǎng)；無(wú)內(nèi)毒素；蛋白、多糖含量高，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高；可作為高效生物反應(yīng)器平臺(tái)。

另外也有研究用酵母系統(tǒng)大規(guī)模重組表達(dá)防御素，除此之外，防御素在農(nóng)業(yè)中可用于農(nóng)作物抗病育種研究。我們課題組2001年將兔防御素 NP-1轉(zhuǎn)入小麥植株，田間抗病蟲鑒定結(jié)果顯示小麥對(duì)于白粉病、葉銹和條銹病的抗性均有較大提高。而將兔防御素 NP-1基因構(gòu)建至植物表達(dá)載體中獲得轉(zhuǎn)基因番茄的抗病實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其對(duì)番茄青枯病具有抗性，為番茄的抗病育種工作奠定了基礎(chǔ)。玉米防御素PDC1抑制了禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，效果還是非常明顯的。另外在小麥里面過(guò)表達(dá)植物防御素MtDef4.2的轉(zhuǎn)基因小麥可顯著增強(qiáng)對(duì)小麥葉銹菌的抗性。

防御素的功能并不僅限于防御，目前隨著研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)防御素功能非常廣譜，HNP可成為兒童體重指數(shù)和腹部脂肪沉積的經(jīng)典標(biāo)記物，另外一個(gè)β-防御素基因突變會(huì)導(dǎo)致家犬毛色的變化這些結(jié)果拓展β-防御素的功能作用。所以說(shuō)防御素的功能研究目前只是發(fā)現(xiàn)冰山一角，更多的功能等待發(fā)掘。

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【交流與討論】

安錫培：我們所從孫老師到胡老師做了20年做的是α-防御素。它的抗菌活性特別強(qiáng)，我記得2003年還幫著做在海軍的潛艇，用在海軍潛水隊(duì)員身上，非常有效，一噴就好，尤其是口腔潰瘍真正是有效的。飼料應(yīng)用也很快，飼料催肥不用其他的東西代替。我們這次沙龍?jiān)豪峡茀f(xié)主要領(lǐng)導(dǎo)都來(lái)了，王局長(zhǎng)、李局長(zhǎng)、桂局長(zhǎng)，還有我們所的胥書記和老書記宋秋生。在座有6個(gè)同事參與過(guò)這個(gè)事情，我們現(xiàn)在根據(jù)王義琴的主旨報(bào)告討論一下，大家有哪些不明白，哪些需要可以進(jìn)一步討論，請(qǐng)大家暢所欲言。

王貴海：聽(tīng)了王義琴的報(bào)告，介紹很系統(tǒng)，應(yīng)該說(shuō)防御素是生物體內(nèi)的，在動(dòng)物、微生物普遍存在的一個(gè)對(duì)外防御體系的重要組成部分。生物體系防御體系是多方面，這么一個(gè)重要的生物學(xué)的防御機(jī)制，而且防御素是一個(gè)小分子多肽蛋白，機(jī)制還是都比較清楚的。它的作用機(jī)制是獨(dú)立發(fā)揮作用還是跟免疫系統(tǒng)聯(lián)合發(fā)揮作用？ 我關(guān)心的這么重要的蛋白α、β防御素，在機(jī)制研究方面好像沒(méi)有在生物學(xué)上形成熱點(diǎn)，為什么？第二個(gè)是問(wèn)題在在生物體內(nèi)它是維持一個(gè)穩(wěn)定的含量，還是在應(yīng)答時(shí)表達(dá)出來(lái)了呢？比如說(shuō)細(xì)菌感染、病毒侵蝕它的表達(dá)量就高起來(lái)了，是α還是β多？作為應(yīng)用發(fā)方面，前途又如何？如果在抗病毒方面有特殊作用那很不錯(cuò)，因?yàn)樗腥N防御機(jī)制，進(jìn)來(lái)可以堵，到了細(xì)胞可以影響轉(zhuǎn)錄，最后是地雷，整個(gè)非常好的一種抗病毒的策略。你們做的是小球藻反應(yīng)器表達(dá)量多少？

胡贊民：目前小球藻中防御素的表達(dá)量可以達(dá)到每升100毫克。

王貴海：那還可以，因?yàn)槭嵌嚯模赡懿环€(wěn)定。

趙世民：這么好東西為什么沒(méi)有應(yīng)用，如果是藥應(yīng)該往哪個(gè)方向發(fā)展，比如說(shuō)鬧肚子、腸炎，黃連素就解決問(wèn)題了，花不了幾塊錢，如果用防御素去解決問(wèn)題那錢要花很多了。我們應(yīng)該瞄準(zhǔn)其它的藥解決不了，只有它才能解決的病，國(guó)際上炒這么熱，胡老師和陳總一直堅(jiān)持下去搞了很多工作。還有一個(gè)就是小球藻，作為植物反應(yīng)器來(lái)講不產(chǎn)生手性的問(wèn)題，治病就治病不會(huì)產(chǎn)生其他副作用，那小球藻反應(yīng)器非常重要。

胡贊民：防御素在應(yīng)用上也不是說(shuō)沒(méi)有進(jìn)展，進(jìn)展挺大的，像臨床一期、二期都有在做，我覺(jué)得問(wèn)題有兩個(gè)方面，一個(gè)是生產(chǎn)成本太高，現(xiàn)在防御素化學(xué)合成活性很低，因?yàn)橛袔讉€(gè)二硫鍵，要從生物里面提取含量非常低的，有時(shí)候是誘導(dǎo)性的，一感染量就上來(lái)了，平常量很低，生產(chǎn)成本是一大塊，化學(xué)合成有護(hù)舷的問(wèn)題。

王貴海：二三個(gè)二硫鍵合成起來(lái)應(yīng)該不困難，這么好藥物多貴都沒(méi)關(guān)系。

胡贊民：目前的問(wèn)題是合成的防御素活性很低，可能跟二硫鍵在體外不能正確配對(duì)有關(guān)系。

王貴海：復(fù)性試驗(yàn)做過(guò)沒(méi)有，加熱破壞二硫鍵，然后復(fù)性，二硫鍵怎么樣，做過(guò)嗎？

胡贊民：功能沒(méi)喪失，煮開(kāi)了防御素的功能也不會(huì)喪失。還有泡在酒精里防御素的功能也不變。

王貴海：這么皮實(shí)的東西，真不錯(cuò)! 因?yàn)槎嚯乃幬锞褪遣环€(wěn)定、嬌氣，但是它的作用很好，你們這個(gè)多肽藥物這么穩(wěn)定在應(yīng)用開(kāi)發(fā)是非常方便的，你們?cè)趧?dòng)物身上做過(guò)實(shí)驗(yàn)嗎？

孫勇如：防御素做成藥，小球藻平臺(tái)建立起來(lái)，我能生產(chǎn)小球藻還能生產(chǎn)凝血因子，說(shuō)明這個(gè)平臺(tái)在基因藥物里面非常有價(jià)值的，現(xiàn)在小球藻問(wèn)題是1995年上了國(guó)家科技攻關(guān)項(xiàng)目，這個(gè)是非常非常不容易，上去了。但是到十五就沒(méi)有了，整個(gè)國(guó)家科技攻關(guān)統(tǒng)統(tǒng)取消，只剩下一個(gè)項(xiàng)目，所以我們組沒(méi)有延續(xù)下去。直到2005年實(shí)際上別的經(jīng)費(fèi)來(lái)維持它，做再深入研究很難。應(yīng)該說(shuō)我一直看好這個(gè)項(xiàng)目，但是發(fā)展還是有些慢。

王貴海：小球藻就是一個(gè)表達(dá)體系，分離提純太難了，得率很低。

孫勇如：關(guān)鍵是基因工程，當(dāng)時(shí)那個(gè)時(shí)候報(bào)道美國(guó)有酵母生產(chǎn)人的防御素，生產(chǎn)出來(lái)沒(méi)有活性。我們的項(xiàng)目成立的時(shí)候這是一個(gè)對(duì)比，那個(gè)時(shí)候還沒(méi)有。

王貴海：小球藻有活性嗎？

孫勇如：當(dāng)時(shí)報(bào)道沒(méi)有，所以選了小球藻。因?yàn)樵孱惱锩婺軌蛞?guī)模培養(yǎng)的原核里面是螺旋藻，真核里面是小球藻。

胡贊民：我接著說(shuō)說(shuō)生產(chǎn)的問(wèn)題，這么多年建小球藻的系統(tǒng)，可以培養(yǎng)10噸級(jí)，表達(dá)防御素的很多。所以用它去做少量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是可以的，目前更看重的是小球藻表達(dá)系統(tǒng)不經(jīng)過(guò)提純直接應(yīng)用，因?yàn)樾∏蛟灞旧硎强梢猿缘模岣呙庖吡Γ岣邉?dòng)物的健康和產(chǎn)量那也很好。所以我們弄了一個(gè)發(fā)現(xiàn)，藥也可以做，為什么現(xiàn)在防御素現(xiàn)在沒(méi)有一個(gè)藥能夠成功的，我想有一個(gè)很重要的原因，就是活性沒(méi)有完全解決。

有一個(gè)像臨床實(shí)驗(yàn)馬甘寧，最后做了很長(zhǎng)時(shí)間，從青蛙身上提取的，最后它的有效性和劑量跟有毒性劑量接近就槍斃了。防御素有個(gè)缺點(diǎn)有血清的情況下就失活，未來(lái)做要藥物是口服的，或者是外用的，做系統(tǒng)用藥還是沒(méi)問(wèn)題的。

安錫培：我們這個(gè)階段討論就到這里，大概提了幾個(gè)問(wèn)題重要的機(jī)理和藥理研究，還有關(guān)于小球藻反應(yīng)器的也值得研究，為什么防御素沒(méi)有形成很好的藥物關(guān)鍵是毒性沒(méi)有解決，現(xiàn)在這個(gè)階段就到這里，下面請(qǐng)陳宇紅做演講。

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【邀請(qǐng)報(bào)告一】

陳宇紅：兔防御素NP-1規(guī)模化生產(chǎn)及其應(yīng)用研究

各位專家、各位老師上午好，我主要把我們研究室在防御素這幾年做的不同方向研究結(jié)果向大家匯報(bào)一下。

兔防御素(Netrophile Peptide-1，NP-1)：來(lái)自兔嗜中性粒細(xì)胞，33個(gè)氨基酸，α防御素，由非常保守的6個(gè)半胱氨酸形成三對(duì)二硫鍵。二硫鍵的正確配對(duì)直接影響到防御素的活性。理化性質(zhì)分析：溶于水和乙醇；經(jīng)100℃處理5分鐘后其生物活性未變化；經(jīng)pH 3.0處理12小時(shí)的生物活性未變化；37℃下經(jīng)胃蛋白酶消化（pH3.2）12小時(shí)的生物活性也未發(fā)生變化。 因?yàn)橛泻芊€(wěn)定性質(zhì)，對(duì)它應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

防御素NP-1規(guī)模化生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)，我們利用發(fā)酵罐可以規(guī)模生產(chǎn)NP-1，在10噸發(fā)酵罐中159小時(shí)，轉(zhuǎn)NP-1基因小球藻干重達(dá)105.57每千克，其中NP-1達(dá)到105毫克每升，產(chǎn)量遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道。轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)我們已經(jīng)獲得農(nóng)業(yè)部環(huán)境釋放許可，并通過(guò)環(huán)境部環(huán)境中心檢測(cè)致敏性分析、急毒實(shí)驗(yàn)、慢毒實(shí)驗(yàn)和三致實(shí)驗(yàn)。

防御素NP-1研究分為以下幾點(diǎn)。第一個(gè)小球藻表達(dá)NP-1可以提高靶動(dòng)物的免疫力促進(jìn)其生產(chǎn)量，項(xiàng)目來(lái)源是國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃防御素NP-1中試生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)及其在飼料添加劑中的應(yīng)用研究。有效性研究，以白羽肉雞作為靶動(dòng)物，參試組至少包括陰性對(duì)照組、抗生素組、對(duì)各組雞進(jìn)行空腹測(cè)量體重，推薦劑量（1% NP-1藻粉），比陰性對(duì)照組（野生藻類粉）增重11.5%；比抗生素組5.4%，多倍劑量組（1% NP-1藻粉）與推薦劑量組無(wú)顯著差異，證明了推薦劑量組作為飼料添加劑喂白羽肉雞具有有效性，并且可以替代抗生素。

安全性實(shí)驗(yàn)，多倍劑量組的血生化、血常規(guī)、、臟器系數(shù)、肌肉率、組織病理學(xué)以及骨髓分析未見(jiàn)異常，證明了推薦劑量組作為飼料添加劑飼喂白羽肉雞具有安全性。

十二指腸病理結(jié)果，陰性對(duì)照，絨毛短粗、排列松散，提示吸收功能較弱； NP-1兩組，絨毛細(xì)長(zhǎng)，排列緊密，提示吸收功能較強(qiáng)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果：絨毛長(zhǎng)度、V/C 比值   CK組 和NP-1各組差異顯著。NP-1兩組之間差異不顯著。

十二指腸病理切片情況，這是千分之一，這是百分之一的NP-1，我們看到腸道有很多小黑點(diǎn)是淋巴系統(tǒng)，免疫細(xì)胞比陰性對(duì)照組多，腸道免疫就很強(qiáng)，陰性對(duì)照組看到比較多的中性粒細(xì)胞，吞噬細(xì)胞比較多，粉紅色的細(xì)胞是嗜酸細(xì)胞，腸道的情況揭示了有炎癥反應(yīng)，有輕度過(guò)敏。脾臟的病理結(jié)構(gòu)，兩個(gè)NP-1組出現(xiàn)了脾小體，陰性對(duì)照白脾不多，而是紅脾的比較多。

我們通過(guò)糞便菌群的情況，我們百分之一跟千分之一NP-1的對(duì)照組，淡綠色的是益生菌或者是非致病，抗生素跟陰性百分比增多了，腸道免疫也是非常好的狀態(tài)。經(jīng)過(guò)上面分析，我們現(xiàn)在初步認(rèn)為這可能就是造成靶動(dòng)物在出欄時(shí)生物量增加的原理，這是一個(gè)初步探討。

小球藻表達(dá)的NP-1具有廣譜的微生物抗性，項(xiàng)目來(lái)源“十二五”國(guó)家科技863計(jì)劃，小球藻表達(dá)兔防御素NP-1臨床前研究，應(yīng)用方向是生物醫(yī)藥，我們通過(guò)研究做了細(xì)菌、真菌實(shí)驗(yàn)，像淋病奈瑟氏菌、對(duì)沙門氏菌引發(fā)的感染有明顯療效等等。

這個(gè)是小球藻表達(dá)NP-1對(duì)多種真菌臨床分離株抑菌效果，株系是北醫(yī)三院真菌室的臨床分離株，采用10 mg的NP-1藥敏紙片對(duì)其有非常明顯的抑制作用，對(duì)照為含有醋酸的緩沖液。小球藻表達(dá)的NP-1對(duì)多種霉菌抑菌效果；株系是中科院微生物研究所環(huán)境分離株，采用10 mg的NP-1藥敏紙片對(duì)其有非常明顯的抑制作用，對(duì)照為甲殼素。小球藻表達(dá)的NP-1對(duì)灰葡萄孢霉引發(fā)的草莓 腐爛的保鮮效果，對(duì)照組：僅用配料噴涂后96小時(shí)霉變率100%，實(shí)驗(yàn)組：NP-1復(fù)配的保鮮劑噴涂后96小時(shí)霉變率20%。基因工程表達(dá)的NP-1對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的藥敏試驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在每毫升8微克情況下有很好抑制作用，對(duì)照選的是頭孢西丁。我們同樣用這個(gè)菌又感染了大鼠，把大鼠后背平行切割，然后是接觸MRSA感染，開(kāi)始給藥，治療5天后處死。之后做了病理切片，已經(jīng)有新的表面形成，有結(jié)痂。小球藻兔防御素NP-1對(duì)MRSA形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，這是進(jìn)一步揭示了NP-1對(duì)細(xì)菌的殺菌機(jī)理。

小球藻表達(dá)的NP-1可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞有絲分裂修復(fù)創(chuàng)傷，合作單位306醫(yī)院，應(yīng)用方向生物醫(yī)藥，表達(dá)NP-1可以修復(fù)ICR小鼠皮膚創(chuàng)傷，通過(guò)肉眼看得出來(lái)，實(shí)驗(yàn)組傷口很小了，對(duì)照組傷口沒(méi)有任何愈合情況，處死以后做了病理切片，表皮在實(shí)驗(yàn)組形成非常良好，沒(méi)有滲出。在實(shí)驗(yàn)組里面沒(méi)有表皮形成，有滲出，肌肉下面組織有壞死了，可以看得出來(lái)傷口好重。

表達(dá)NP-1可以修復(fù)豚鼠的口腔黏膜損傷，就是口腔潰瘍，每日兩次NP-1 20毫克，76小時(shí)處理，潰瘍明顯減小，在對(duì)照組看的非常清楚，潰瘍清晰可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組里面鱗狀上皮完全愈合，沒(méi)有滲出，對(duì)照組沒(méi)有愈合，有明顯的滲出。

小球藻表達(dá)的NP-1可以直接促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)和再生，合作單位北京大學(xué)人民醫(yī)院，應(yīng)用方向是生物醫(yī)藥。神經(jīng)遞質(zhì)L-谷氨酸的興奮作用相當(dāng)程度上受兔防御素NP-1影響。防御素的作用機(jī)制可能涉及突觸傳遞的改變，且由神經(jīng)遞質(zhì)L-谷氨酸介導(dǎo)。5-羥色胺受體可能參與了NP-1與感覺(jué)神經(jīng)元的相互作用。兔防御素NP-1與感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞膜相互作用的機(jī)制可能是通過(guò)防御素中第十四位酸性氨基酸Glu(谷氨酸)的羧基與膜受體形成氫鍵作用。對(duì)神經(jīng)的保護(hù)功能可能是通過(guò)阻礙細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞增殖和促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷愈合。

我們?cè)诖笫蟮淖巧窠?jīng)做一個(gè)套管，2個(gè)月會(huì)自動(dòng)在體會(huì)吸收，中間留了5毫米縫隙，設(shè)置了3個(gè)組，一個(gè)是NP-1組，在套管里面100毫克的NP-1，第二個(gè)給了NGF，第三組是氯化鈉，持續(xù)8周實(shí)驗(yàn)，測(cè)試了很多參數(shù)，像神經(jīng)傳導(dǎo)率、老鼠走路步態(tài)等等。現(xiàn)在給大家看一下神經(jīng)元胞體逆行示蹤，氯化鈉神經(jīng)形成的非常差，我們又做了有髓鋨酸染色，在一定波長(zhǎng)下如果長(zhǎng)出來(lái)就可以看細(xì)胞，NP-1和NGF經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，也發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元胞體恢復(fù)沒(méi)差異，氯化鈉這一組基本上沒(méi)怎么形成。

以上是我們對(duì)NP-1不同應(yīng)用方向進(jìn)行一下探討，我們也很希望在下面的工作當(dāng)中能夠獲得更多國(guó)家經(jīng)費(fèi)的支持或者是企業(yè)橫向資助，不管哪個(gè)方向都能夠促使項(xiàng)目真正做到產(chǎn)業(yè)化。在這個(gè)過(guò)程中非常感謝孫勇如、趙世民、 胡贊民老師的支持，國(guó)家863計(jì)劃，中科院重點(diǎn)部署項(xiàng)目、國(guó)家科技支撐計(jì)劃和保羅生物的資助，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的支持和管理，參與本研究的中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部、北京大學(xué)人民醫(yī)院，306醫(yī)院工作人員和學(xué)生。

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【交流與討論】

安錫培：下面我們針對(duì)陳宇紅的報(bào)告進(jìn)行討論，看看防御素目前在應(yīng)用方面，還有哪些比較成熟的。

趙世民：我記得還有一個(gè)個(gè)例，胡贊民的同學(xué)孩子眼睛真菌感染，知道他搞這個(gè)，就跟他要了一點(diǎn)，他那個(gè)同學(xué)真敢干，就給他的孩子使用，后來(lái)孩子就好了，而且上學(xué)了，后來(lái)我就不知道怎么樣了，這是個(gè)例，起碼是對(duì)真菌感染有效。

魏榮瑄：我聽(tīng)到是挺震撼的，還能抗防腐，假如說(shuō)這樣的話，小肽的東西，又是廣譜的，開(kāi)辟了一個(gè)很好的思路，這個(gè)是很鼓舞的。在一個(gè)小球藻表達(dá)系統(tǒng)很好，在北大困難時(shí)期說(shuō)一個(gè)小球藻片頂一個(gè)饅頭非常的吸引人，這個(gè)系統(tǒng)結(jié)合藥物、廣譜性，再有小球藻表達(dá)系統(tǒng)很有應(yīng)用性。

王貴海：我想問(wèn)一個(gè)問(wèn)題，它的應(yīng)用前景非常好。“十二五”項(xiàng)目作為增加動(dòng)物的抗病性和促進(jìn)生長(zhǎng)已經(jīng)做了不少實(shí)驗(yàn)，證明了它的有效性和安全性。有效性我注意到增長(zhǎng)百分之十一點(diǎn)幾，抗病性是怎么做的？我看你做了很多病理切片，整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做過(guò)嗎？

陳宇紅：我們分不同的應(yīng)用方向，您說(shuō)的有效性是我承擔(dān)的飼料添加劑的課題，實(shí)際上為什么體重會(huì)增多，通過(guò)病理切片發(fā)現(xiàn)腸道和脾臟免疫提高了，對(duì)病源微生物免疫，比如說(shuō)腸道里的細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，提高的是機(jī)體的機(jī)能的。

王貴海：但一定要證明在個(gè)體水平上。對(duì)照組是怎么做的？

陳宇紅：我們做了一個(gè)對(duì)照野生小球藻對(duì)照組。

王貴海：要做感染組和感染對(duì)照組，看看發(fā)病的情況。經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的試驗(yàn)，才能作為正式畜牧藥物和營(yíng)養(yǎng)品上市，在組織水平上也要做大量的觀察，所有的試驗(yàn)動(dòng)物都要宰殺做病理。

陳宇紅：我們做了六個(gè)平行攔。

王貴海：你們是做雞的是嗎？

陳宇紅：對(duì)。

王貴海：100只雞太好做了，你可以試試做禽流感。

陳宇紅：我的課題主要是做飼料添加劑。

王貴海：這種飼料增加了免疫力，死亡率降低了。你的們病理切片很好、不錯(cuò)的。產(chǎn)品的研發(fā)要作必須要按照規(guī)范去做，這是一個(gè)問(wèn)題。第二個(gè)有效性，你說(shuō)多倍劑量組沒(méi)有負(fù)作用，有多少倍？

陳宇紅：有一個(gè)推薦劑量組，認(rèn)為按照這個(gè)劑量，多倍劑量組是5到10倍。

王貴海：增加有效性，沒(méi)有增加毒性。安全性一定要按照要求，多倍提法太含糊，增加百倍的飼料喂食動(dòng)物，要做多長(zhǎng)時(shí)間的觀察，審視對(duì)以后遺傳有沒(méi)有影響。

陳宇紅：您說(shuō)的這個(gè)評(píng)價(jià)我們是做1000倍的。

胡贊民：王局長(zhǎng)您說(shuō)的非常好，作為飼料添加劑的話是靶動(dòng)物安全性5倍、10倍是可以的，如果做毒性評(píng)價(jià)是小鼠，在小鼠里面是1000倍的。

王貴海：這個(gè)我是外行，數(shù)據(jù)要規(guī)范，要按照食品管理辦法去做，才能通過(guò)食品添加劑產(chǎn)品的證書。

胡贊民：還有農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)的。

王貴海：你們拿到的是什么？

陳宇紅：致敏性分析、急毒實(shí)驗(yàn)、慢毒實(shí)驗(yàn)，三致實(shí)驗(yàn)。

孫勇如：為什么我們?cè)O(shè)計(jì)的時(shí)候小球藻表達(dá)兔防御素NP-1不表達(dá)了人防御素，就怕使用時(shí)間長(zhǎng)了抗生素失效了。

王貴海：兔防御素NP-1就不耐藥了？

孫勇如：生產(chǎn)時(shí)為什么不生產(chǎn)人防御素而生產(chǎn)兔防御素NP-1，那樣對(duì)人沒(méi)威脅，對(duì)兔子就有威脅了，抗生素是一個(gè)大問(wèn)題，本世紀(jì)初出現(xiàn)了萬(wàn)古霉素，大家覺(jué)得抗生素不靈了，現(xiàn)在十幾年來(lái)了只增加了14個(gè)病理耐藥菌出現(xiàn)，大家比較信心。最近2014年11月份，中國(guó)報(bào)道了出現(xiàn)了對(duì)多元菌素B的耐藥菌出現(xiàn)了，這個(gè)菌2015年10個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)，到去年2016年又出現(xiàn)了耐藥性，這個(gè)耐藥性多元菌素出現(xiàn)了，大量應(yīng)用在畜牧業(yè)上，利用非常廣泛，耐藥菌的出現(xiàn)了大家非常恐慌。但是我們防御素有沒(méi)有效果，不知道。

胡贊民：現(xiàn)在防御素、抗菌素用于調(diào)節(jié)防御能力，我們用的劑量是一公斤飼料加一克小球藻，一毫克的NP-1，一公斤飼料里面只有一毫克的，它的劑量是殺不了菌的。

王貴海：它跟藻體結(jié)合以后，到了雞肚子里肽還存在嗎？

胡贊民：過(guò)了十二指腸以后，到了空腸以后就沒(méi)有了。

王貴海：到哪吸收的？

胡贊民：實(shí)際上是刺激腸道，刺激它免疫的反應(yīng)，腸道細(xì)胞及反應(yīng)，拉出來(lái)的時(shí)候沒(méi)有了。

王貴海：兔的防御肽吃了以后在什么地方吸收，要做防御素的生理代謝，一旦吃進(jìn)去到胃里就變成氨基酸了，如果人吃多肽藥物是腸溶的，這個(gè)才起作用。用小球藻做兔子防御素做添加劑是非常好的想法，不用把兔防御素NP-1提取出來(lái)，表達(dá)就行了，定量就行了，規(guī)范做飼料小球藻粉，飼料標(biāo)準(zhǔn)定下來(lái)，多少克藻分，多少肽裝到袋子里就可以了，然后觀察產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

胡贊民：我們一直想要做藥肽原理學(xué)。

王貴海：最好做藥代的研究，不用雞做，用老鼠做更方便。

趙世民：讓誰(shuí)做都拿錢啊，所里經(jīng)費(fèi)是有限的，你找誰(shuí)都要交錢的。

孫勇如：我曾經(jīng)胃出血疼死了，就煮小球藻，煮開(kāi)了喝了就特別好。

王貴海：這是我剛才的一個(gè)建議，盡快突破作為飼料研發(fā)，這個(gè)最容易突破的，完了以后這么多飼料不管是雞還是其他都有很大市場(chǎng)。

趙世民：您說(shuō)的跟我們的思想真的不一樣。

王貴海：你要做藥會(huì)非常難，如果做飼料，市場(chǎng)效益也會(huì)非常好。所以這么好的東西一定要選一個(gè)很好的突破點(diǎn)，如果作藥， 必須要選擇一個(gè)合適的適應(yīng)癥，然后一步步按成藥性研究。我看好你們這個(gè)防御素，目標(biāo)一定要清，然后走一個(gè)非常捷徑的路，容易走。

安錫培：謝謝王局，王局每次都能說(shuō)到點(diǎn)子上，下面請(qǐng)鄧婷婷博士發(fā)言。

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【邀請(qǐng)報(bào)告二】

鄧婷婷：小球藻表達(dá)體系研究進(jìn)展

小球藻作為它的特性和生物反應(yīng)前面兩位報(bào)告人都提到了，易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、成本低等等。小球藻跟其他生物細(xì)胞相比，有生產(chǎn)上的優(yōu)勢(shì)。目前用小球藻作為生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)化，用的啟動(dòng)子、載體大部分來(lái)自于高等植物，也是真核生物。

小球藻報(bào)告和篩選基因有所體現(xiàn)，文獻(xiàn)用的最多是螢火蟲和綠色熒光蛋白比較多的等等，這些報(bào)道應(yīng)用情況也不知道應(yīng)用成為成熟，今天聽(tīng)報(bào)告感覺(jué)防御素應(yīng)用還是比較多的。

轉(zhuǎn)基因小球藻的表達(dá)水平和穩(wěn)定性受很多因素影響，外源基因表達(dá)水平低甚至表達(dá)被抑制的狀況經(jīng)常發(fā)生；外源基因表達(dá)的最大困難是缺乏足夠的調(diào)控序列；另外，未使用偏好密碼子、不正確的聚腺苷酸化、不適當(dāng)?shù)暮诉\(yùn)輸以及不穩(wěn)定的mRNA，均可能導(dǎo)致基因沉默。

小球藻生物反應(yīng)器的發(fā)展，優(yōu)化已建成的遺傳轉(zhuǎn)化體系，提高外源基因的轉(zhuǎn)化效率和表達(dá)水平，形成高效穩(wěn)定的外源基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；深入開(kāi)展小球藻的分子遺傳學(xué)研究，使其成為既具良好培養(yǎng)基礎(chǔ)和應(yīng)用潛力，又具有清晰遺傳背景的新型研究體系。

小球藻應(yīng)用展望，前幾個(gè)報(bào)告人都提到了，一作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)各類物質(zhì)；二利用基因工程培育優(yōu)良藻種；三藻類天然產(chǎn)物的生產(chǎn)；四藻類基因在農(nóng)作物改良中的應(yīng)用。

我簡(jiǎn)單講的就是這些，也比較淺顯，拋磚引玉，多交流。

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【交流與討論】

安錫培：剛才鄧婷婷講了一下小球藻研究趨勢(shì)、應(yīng)用和表達(dá)體系，我們根據(jù)她講的內(nèi)容，結(jié)合前兩段再進(jìn)行討論，大家看看還有什么提出的想法和問(wèn)題。

孫勇如：我原來(lái)的想法希望小球藻作為生物反應(yīng)器能夠越來(lái)越多的被應(yīng)用，所以退休前2004年就寫了一篇文章《小球藻新型的生物反應(yīng)體》，我希望大家能夠引起重視，除了這個(gè)防御素轉(zhuǎn)到小球藻，凝血基因轉(zhuǎn)到小球藻，如果這個(gè)平臺(tái)建好的話，基因工程藥物類是非常好的。防御素正確表達(dá)了，有功能了，用小球藻來(lái)證明到底行不行？最后表達(dá)了是有功能的，當(dāng)然沒(méi)有最后成作用，總覺(jué)得這條路是通的，這個(gè)平臺(tái)作為基因工程藥，我覺(jué)得有很大優(yōu)勢(shì)，不光是一個(gè)新型藥，多生成一個(gè)藥來(lái)。但是以前沒(méi)做好，沒(méi)選擇抗癌的藥，跟藥一接觸就知道，人家一聽(tīng)是抗癌有興趣我跟你合作，防御素跟抗癌沒(méi)關(guān)系就不想投錢，抗癌的藥喊的響，防御素沒(méi)喊響，我希望在這方面工作能夠繼續(xù)。

何鳳琴：你說(shuō)抗癌，我是動(dòng)物所的，今天特別感謝遺傳發(fā)育所的邀請(qǐng)，2005年以前接了一本書，讓我寫蒼蠅的研究，后來(lái)查出癌癥了，就不想簽合同了。我研究蒼蠅的抗菌肽、抗菌蛋白、防御素，我也是從北大出來(lái)的，我2005年退休的，退休以后我舍不得我那蒼蠅，兩個(gè)組一間房里，我后來(lái)腫瘤又復(fù)發(fā)了，長(zhǎng)了五個(gè)以上腫塊，我后來(lái)就吃那個(gè)蛆，現(xiàn)在已經(jīng)過(guò)去12年了，沒(méi)事兒了。

孫勇如：康富新（音）是從蟑螂提取的藥。

李文彬：是從蟑螂用酒精提取的，修復(fù)胃黏膜，美洲大鐮。

孫勇如：我覺(jué)得蛆里面起作用的還是抗菌肽。

湯火順：抗菌肽的作用很大，我做過(guò)法國(guó)蝸牛，一炒非常的香，外面的人聞到就找到我炒的地方來(lái)，你們?cè)诟墒裁闯吹哪敲聪悖揖桶堰@個(gè)蛆配合飼料養(yǎng)法國(guó)蝸牛，長(zhǎng)的非常漂亮。我后來(lái)養(yǎng)牛蛙的時(shí)候就更好了，還沒(méi)有斷尾上陸地時(shí)候吃蛆長(zhǎng)的非常快。那個(gè)時(shí)候養(yǎng)了7個(gè)月蛙就達(dá)到1斤左右了。后來(lái)我把蛆加工完以后做剛才提到的抗菌肽的問(wèn)題，和四個(gè)細(xì)菌和青霉素比較，都非常的有效。有的比青霉素抑菌效率更高，為什么要提到這個(gè)問(wèn)題？因?yàn)榍L(zhǎng)非常快，繁殖非常快、成本非常底，奶粉跟紅糖就可以了。

何鳳琴：現(xiàn)在我叫神蟲。吃完一喝水挺好的。

孫勇如：吃了幾天？

何鳳琴：一邊干活一邊吃，拿微波爐就成了，餓了就吃。

胡贊民：要直接提取的話也容易。

何鳳琴：提取費(fèi)錢。

趙世民：這些可能要用綜合性的東西，真正提取出來(lái)以后，要分析它，藥在生物學(xué)怎么弄的，從哪排出來(lái)。如果不提取它，就像中藥似的，就混在一起吃了治病。

孫勇如：就像康富新的藥說(shuō)明副作用，劑量什么尚不明確、原理是什么尚不明確，那藥理就批下來(lái)了。像胃潰瘍也是，康富新你喝了就行。

趙世民：我今天聽(tīng)三位的演講，有了新的了解，做了多少工作，占了多大比例，對(duì)我們以后有啟示作用，哪些方面還沒(méi)有涉獵，我們應(yīng)該在這個(gè)方面多下功夫，哪個(gè)方面做了大量工作，我們可以少在哪個(gè)方面工作。

我們今天是防御素的沙龍，也涵蓋了小球藻的使用，剛才王局長(zhǎng)提了非常重要的一點(diǎn)，你要找一個(gè)急病，比如說(shuō)現(xiàn)在小學(xué)、幼兒園大量的一陣一陣的發(fā)生口腔里面的病（手足口），而且反復(fù)的發(fā)作，特痛苦，也沒(méi)什么藥，回來(lái)就是休息、喝水，到醫(yī)院檢查完了醫(yī)院告訴你好了才能上學(xué)。這些東西確實(shí)有用，就在這方面做一個(gè)必要開(kāi)發(fā)，如果光提廣譜，一提廣譜人家覺(jué)得就是紅藥水什么都管用。瞄準(zhǔn)一個(gè)開(kāi)發(fā)一個(gè)，然后再找第二個(gè)。咱們國(guó)家藥品批下來(lái)也是相當(dāng)難的，你要做好幾年的戰(zhàn)斗準(zhǔn)備。我聽(tīng)說(shuō)美國(guó)一個(gè)新藥10億美元10年，中國(guó)是不是可以快一點(diǎn)，但是也需要投入大量的經(jīng)費(fèi)，所以咱們書記也在這，將來(lái)在這方面也跟所長(zhǎng)研究研究，能夠?qū)λ麄兘M看中一個(gè)項(xiàng)目給予一定資助，打響一炮。真的到一期臨床的時(shí)候，就不是遺傳發(fā)育所負(fù)擔(dān)得起的，就要找合作單位了。

孫勇如：那個(gè)是時(shí)候需要跟企業(yè)合作。

安錫培：我們時(shí)間正好，剛才世民算做了一個(gè)小結(jié)，我們現(xiàn)在看來(lái)它的潛力很大，也需要進(jìn)一步完善，需要克服。

王貴海：我個(gè)人感覺(jué)今天的沙龍開(kāi)的還是不錯(cuò)的，從選題上作為具有免疫功能的重要分子，具有重要的理論研究和應(yīng)用意義。作為免疫系統(tǒng)，分子作用機(jī)制很多還是不清楚的，在基礎(chǔ)研究、前沿研究當(dāng)中有重要的研究?jī)r(jià)值的。我建議能不能在基礎(chǔ)研究當(dāng)中深入做點(diǎn)東西，可以和別所分子免疫團(tuán)隊(duì)合作。這是一個(gè)方面。

第二個(gè)建議，所里的老同志一直堅(jiān)持在應(yīng)用方向開(kāi)發(fā)有價(jià)值應(yīng)用前景的東西，承擔(dān)院里“十二五”項(xiàng)目，承擔(dān)國(guó)家項(xiàng)目，重點(diǎn)項(xiàng)目，也得到了支持。希望能夠集中方向，在原有比較好的基礎(chǔ)上有所突破。瞄準(zhǔn)幾個(gè)方向。第一個(gè)比較重要就是在飼料添加劑方面，現(xiàn)在可以在企業(yè)方面運(yùn)作，或者我們自己成立一個(gè)企業(yè)來(lái)推動(dòng)這個(gè)成果。因?yàn)楹芏鄻?biāo)準(zhǔn)已經(jīng)拿到了。但是你要作為一個(gè)飼料添加劑還有許多研究去做。如果做好了，打到國(guó)內(nèi)市場(chǎng)、國(guó)外市場(chǎng)都可以的。

雞的抗病性對(duì)養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)來(lái)講很重要的。如果能在普通的流行性疾病上能夠起作用，如果搞一點(diǎn)研究能抗禽流感那就更好了。就是說(shuō)，一定要選擇國(guó)家需求大的東西，做一些基礎(chǔ)性的工作。我覺(jué)得最近一條路做成飼料添加劑的高端產(chǎn)業(yè)是可以的。

在人類疾病研究來(lái)講，要選準(zhǔn)方向，它對(duì)很多病都有作用，特別是作為免疫性分子對(duì)黏膜性疾病有作用明顯。但是選擇疾病最好是選擇現(xiàn)在還沒(méi)有好藥來(lái)治的病，根據(jù)防御素作為成藥研究的特點(diǎn)，怎么做最容易做，比如做外用藥，涂抹，包括皮膚、抗菌，弄好了跟創(chuàng)可貼弄在一起就很好，化妝品也可以。這些根據(jù)防御素本身多肽的特點(diǎn)，在成藥研究少走路，給老百姓解決大問(wèn)題。所以在適應(yīng)癥選擇問(wèn)題上要好好想想，希望我們團(tuán)隊(duì)繼續(xù)努力作出突破性工作。